Испанский монарх, и раньше не питавший особых чувств к сыну, теперь нашёл удобный момент для отстранения дона Карлоса от престола и лишения его титула королевского наследника. Столь серьёзное решение должны были поддержать и государственные советники, которых монарх созвал к себе с тем, чтобы решить вместе с ними дальнейшую судьбу сына. Филипп II сообщал, что более не намерен терпеть выходки своего ребёнка, в судьбе которого он старался принимать самое активное участие, и просил Совет дать согласие на арест наследника.

Однако ждать ответа советников монарх не стал. Он сразу же заточил принца под стражу, а спустя несколько дней отправил его в тюрьму. Там Карлосу не позволяли никаких излишеств, и даже когда королева Изабелла решила навестить своего пасынка, ей категорически запретили это сделать. Безутешный инфант перестал есть, отказался от одежды и глотал лёд, что привело к болезненной лихорадке.

Несколько дней врачи пытались его вылечить, однако никакие лекарства принцу не помогали. Ему становилось хуже, пока, наконец, придворный врач не сообщил монарху, что Карлос, возможно, доживает свои последние дни. Такой поворот событий был весьма выгоден королю, и он велел лекарю не предпринимать никаких действий, чтобы вдруг не вылечить умирающего наследника. А тому с каждым днём становилось всё хуже. Когда о начавшейся агонии доложили Филиппу, тот решил в последний раз навестить сына. Однако Карлос уже никого не узнавал. Он умер на рассвете 24 июля 1568 года.

Его похоронили со всеми почестями в одной из мадридских церквей, а спустя несколько месяцев умерла и его бывшая невеста, третья жена короля Филиппа, Изабелла. Считается, что причиной её смерти была внезапная потеря ребёнка, которого королева носила под сердцем несколько месяцев, и последовавшее за этим событием заражение крови.

Наследников у монарха не оставалось, поэтому он решился на четвёртый брак. Следующей его женой, по воле судьбы, снова стала невеста сына, Анна Австрийская, с которой Филипп II был обвенчан в 1570 году и которая подарила уже немолодому супругу сына, ставшего впоследствии испанским королём Филиппом III.