До сих пор неизвестно, носили ли отношения Карлоса и Изабеллы лишь платонический характер. Скорее всего, молодая королева оставалась преданной своему супругу и ни в чём не нарушила обет верности, данный в день венчания. Тем не менее к принцу она всегда относилась слишком трепетно и с заботливой, материнской любовью. Однако были и те, кто, недолюбливая иностранку, пытался внушить царствующему монарху, что его супруга и сын связаны более тесными узами. Филипп II даже несколько раз следил за Изабеллой, однако ничего подозрительного так и не нашёл.

А Карлос, влюблённый в молодую королеву, сгорал от нежных чувств к бывшей невесте и ненависти к лицемерному родителю. Испанский король в самом деле слыл в Европе монархом лживым, хладнокровным и хитрым. Казалось, сын перенял у него самые плохие черты, став ещё более жестоким и бесчеловечным. А жизнь преподносила наследнику ещё более суровые испытания.

В начале мая 1562 года семнадцатилетний инфант, спускаясь по лестнице своего дворца, неосторожно оступился, покатился по ступеням и сильно ударился об пол. Принца, потерявшего сознание, отнесли в его спальню, а врачи, осмотрев дона Карлоса, посчитали, что жить ему осталось недолго. Однако королевский врач Андрео Басилио пошёл на крайние меры и вскрыл череп больного, выпустив оттуда жидкость. Тем самым врач вернул принца к жизни. К сожалению, наследник частично остался парализованным, а мучительные головные боли преследовали его всю жизнь.

Когда Карлос немного поправился, отец решил женить сына на принцессе Анне Австрийской, которая была младше наследника на четыре года и приходилась ему кузиной. Знакомый с ней с раннего детства, Карлос не стал противиться предстоящему союзу, однако события внезапно приняли совершенно иной оборот.

Инфант, сгорающий от ненависти к собственному отцу, имел неосторожность сообщить одному церковнику о намерении убить собственного родителя. Священник, испугавшись за жизнь своего покровителя, Филиппа II, не замедлил доложить тому о нависшей угрозе.